<h1><b style="color: rgb(22, 126, 251); font-size: 22px;">青春期前男性生育力保存的研究進(jìn)展及新觀點(diǎn)</b></h1> <p class="ql-block"><b style="font-size: 15px;">Fertility preservation in boys: recent developments and new insights. Human Reproduction Open, pp. 1–18, 2020. doi:10.1093/hropen/hoaa016</b></p><p class="ql-block"><b style="font-size: 15px;">?</b></p> <p class="ql-block" style="text-align: center;"><br></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="font-size: 20px; color: rgb(22, 126, 251);">摘 要</b></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="font-size: 20px; color: rgb(22, 126, 251);">?</b></p><ul class="ql-block"><li><b><u>背景</u></b>：不育是癌癥及其他非惡性疾病治療過程中可能導(dǎo)致的一個(gè)主要副作用。其可能的原因是精原干細(xì)胞（SSCs）的丟失和/或睪丸體細(xì)胞（如支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞）的功能受損。盡管精子凍存已經(jīng)成為青春期后男性生育力保存的一線治療方案，但此方案卻無法用于青春期前的男性患者。對(duì)于那些有較高風(fēng)險(xiǎn)喪失生育能力卻又無法產(chǎn)生成熟精子的患者而言，睪丸組織凍存或許可以成為保全其生育能力的替代性實(shí)驗(yàn)方案。</li><li><b><u>目的和方法</u></b>：本綜述匯總了針對(duì)有較高風(fēng)險(xiǎn)喪失生育能力的青春期前男性生育力保存的最新臨床實(shí)踐方案和實(shí)驗(yàn)性治療方法，同時(shí)闡釋了此類患者的管理策略。</li><li><b><u>檢索方案</u></b>：基于研究機(jī)構(gòu)和臨床實(shí)踐進(jìn)展的文獻(xiàn)檢索，本文闡述了有較高風(fēng)險(xiǎn)喪失生育能力的青春期前男性生育力保存患者的管理策略及實(shí)驗(yàn)性治療方法。此外，我們還開展了針對(duì)發(fā)表過睪丸組織凍存論文的歐洲和北美醫(yī)療機(jī)構(gòu)/協(xié)作組的調(diào)查研究。</li><li><b><u>結(jié)果</u></b>：自從1994年小鼠的精原干細(xì)胞移植被報(bào)道后，其臨床應(yīng)用及轉(zhuǎn)化已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，其中規(guī)范的睪丸組織凍存在動(dòng)物模型中逐步建立和完善，并作為一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性療法提供給臨床患者。人睪丸組織移植的有效性和安全性在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物得到驗(yàn)證，但用于臨床之前，相應(yīng)的醫(yī)學(xué)和倫理問題亟待解決。2012年開展的調(diào)查顯示，睪丸組織凍存用于青春期前男性生育力保存逐漸增多。全球24個(gè)開展睪丸組織凍存用于男性患兒生育力保存的協(xié)作醫(yī)療中心的數(shù)據(jù)顯示，超過1033例男性患兒（年齡3個(gè)月-18歲）接受了睪丸組織采集及凍存，進(jìn)行生育力保存。</li><li><b style="color: inherit;"><u>局限性及警示：</u></b><span style="color: inherit;">研究數(shù)據(jù)并沒有涵蓋全球范圍內(nèi)的所有生殖中心，其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)可能也在開展睪丸組織凍存。因此本研究中的數(shù)據(jù)可能無法代表全球生殖醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的全貌。此外，關(guān)于青春期前男性生育力保存的核心倫理問題依舊在于此類干預(yù)措施仍是實(shí)驗(yàn)性的。</span></li><li><b style="color: inherit;"><u>更廣泛的應(yīng)用：</u></b><span style="color: inherit;"> 多學(xué)科協(xié)作團(tuán)隊(duì)在應(yīng)用及發(fā)展針對(duì)有較高風(fēng)險(xiǎn)喪失生育能力的青春期前男性生育力保存的治療策略時(shí)，可應(yīng)用本文闡述的較新方法。</span></li><li><b style="color: inherit;"><u>研究資助/利益沖突：</u></b><span style="color: inherit;">此項(xiàng)研究得到了ESHRE（歐洲生殖及胚胎學(xué)會(huì)）的支持，所有作者均沒有利益沖突。</span></li><li><b style="color: inherit;"><u>關(guān)鍵詞：</u></b><span style="color: inherit;">冷凍保存/體外精子發(fā)生/生育力保存/生育力恢復(fù)/青春期前男性/精原干細(xì)胞/睪丸組織冷凍/睪丸/移植</span></li><li><b style="color: inherit;"><u>內(nèi)容提要</u></b><span style="color: inherit;">：對(duì)兒童期接受化療和/或放療的男性而言，其未來生育力情況可能長(zhǎng)期影響生活質(zhì)量。因此，亟需建立新的策略使此類患者可以獲得自己后代并應(yīng)用于臨床。鑒于青春期前成熟精子仍未產(chǎn)生，因此睪丸組織凍存可能是目前保存兒童生育潛能的唯一方法。從青春期前的睪丸組織獲取成熟精子是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。目前在靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)獲得成功。因此全球越來越多的醫(yī)療機(jī)構(gòu)開始將睪丸組織凍存作為一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性治療方法，以便患者未來從復(fù)蘇后的睪丸組織獲取成熟精子。目前研究焦點(diǎn)包括：體外睪丸組織培養(yǎng)和睪丸組織或細(xì)胞自體移植。本綜述論述了青春期前男性生育力保存領(lǐng)域的研究進(jìn)展，同時(shí)論述了制約此項(xiàng)技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)。</span></li></ul><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="font-size: 22px; color: rgb(22, 126, 251);">前 言</b></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="font-size: 22px; color: rgb(22, 126, 251);">?</b></p><p class="ql-block">存在于男性生殖腺中的SSCs是生精的基礎(chǔ)，即由其產(chǎn)生具有受精能力的成熟精子。精子的產(chǎn)生自青春期開始并貫穿成年期。除細(xì)胞毒性治療外，諸如Klinefelter綜合征和Fanconi綜合征等遺傳學(xué)異常也與生殖細(xì)胞喪失相關(guān)。因此，適時(shí)地凍存含有精原干細(xì)胞的睪丸組織是保存青春期前男性生育力的可行性策略。針對(duì)腫瘤治療或其他導(dǎo)致不育的疾病，目前有多種正在研究的恢復(fù)男性生育力的方法，其中包括精原干細(xì)胞或睪丸組織移植和體外精子發(fā)生。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">在世界范圍內(nèi)，越來越多的機(jī)構(gòu)在為面臨精原干細(xì)胞喪失的青春期前男性提供生育力保存。第一項(xiàng)針對(duì)青春期前男性的生育力保存的計(jì)劃始于2002年，近年來，提供凍存服務(wù)的中心數(shù)量穩(wěn)步增長(zhǎng)<i style="font-size: 15px;">（Picton et al., 2015）</i>。我們預(yù)計(jì)，在不久的將來，患者將咨詢恢復(fù)其生育能力有哪些臨床選擇。因此，本綜述將描述當(dāng)前的臨床實(shí)踐，患者納入策略和用于保存和恢復(fù)處于生育力喪失高風(fēng)險(xiǎn)的青春期前男性生育力的實(shí)驗(yàn)性方法。此外，本文還將探討與生育保護(hù)和恢復(fù)有關(guān)的科學(xué)、道德和法律問題。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b><u>放射和細(xì)胞毒性治療對(duì)睪丸功能的影響</u></b></p><p class="ql-block">睪丸細(xì)胞，尤其是快速分裂的生殖細(xì)胞，對(duì)放化療高度敏感。生育力恢復(fù)的可能性將取決于睪丸內(nèi)精原細(xì)胞群的存活與否。低細(xì)胞毒性劑量將耗盡<u>分化的精原細(xì)胞</u>，但可能僅導(dǎo)致暫時(shí)的生精停滯，而<u>儲(chǔ)備的SSCs</u>可能存活并恢復(fù)有絲分裂活性以產(chǎn)生分化的精原細(xì)胞。如果損傷嚴(yán)重且SSCs數(shù)量急劇減少，則可能要多年以后才能恢復(fù)。如果所有SSCs都被耗盡，患者將永久不育。精原細(xì)胞已被證明在生命的各個(gè)階段（包括兒童時(shí)期）都易于遭受這種損耗<i style="font-size: 15px;">（Whitehead et al., 1982; Relander et al., 2000; Jahnukainen et al., 2011）</i>。此外，患者年齡、既往睪丸病理以及個(gè)體對(duì)癌癥治療毒性的敏感性也可能影響治療后生精上皮支持精子發(fā)生的潛能<i style="font-size: 15px;">（Wyns et al., 2010; Rives et al., 2012）</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">在一篇系統(tǒng)性文獻(xiàn)綜述中，國際兒童癌癥遠(yuǎn)期效應(yīng)指導(dǎo)方針協(xié)調(diào)組發(fā)現(xiàn)了環(huán)磷酰胺、甲草胺和丙卡巴嗪對(duì)精子形成具有不利影響的證據(jù)<i style="font-size: 15px;">（Skinner et al., 2017）</i>?；谕榛瘎┑脑煅杉?xì)胞移植（HSCT）調(diào)理方案（如白消安和環(huán)磷酰胺，氟達(dá)拉濱或美法侖）和異環(huán)磷酰胺也與生精能力受損有關(guān)。數(shù)據(jù)表明烷化劑的劑量與生精能力受損之間存在關(guān)聯(lián)<i style="font-size: 15px;">（Skinner et al., 2017）</i>。<u>當(dāng)環(huán)磷酰胺當(dāng)量<4000mg/m2時(shí)</u>，發(fā)生無精癥和少精癥的可能性很小<i style="font-size: 15px;">（Green et al., 2014）</i>。但是，預(yù)測(cè)生精能力受損、無精子癥或任何絕對(duì)安全的下限閾值劑量無法確定<i style="font-size: 15px;">（Green et al., 2014; Skinner et al., 2017）</i>。聯(lián)用烷化劑被認(rèn)為對(duì)精子發(fā)生有額外的不利影響<i style="font-size: 15px;">（Skinner et al., 2017）</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">檢測(cè)每個(gè)生精小管橫截面的精原細(xì)胞數(shù)量<i style="font-size: 15px;">（Masliukaite et al., 2016）</i>是一種評(píng)估疾病或其治療對(duì)青春期前男性睪丸組織質(zhì)量和生育潛能不良影響的方法<i style="font-size: 15px;">（Poganitsch-Korhonen et al., 2017; Stukenborg et al., 2018a）</i>。通過該法證實(shí)，暴露于烷化劑的患者，尤其是當(dāng)環(huán)磷酰胺當(dāng)量> 4000mg/ m2時(shí)，與正常對(duì)照或非烷化劑治療的患者相比，精原細(xì)胞的數(shù)量顯著減少<i style="font-size: 15px;">（Poganitsch-Korhonen et al., 2017）</i>。因此，為了收集足夠數(shù)量的精原細(xì)胞來保存生育力，應(yīng)在開始烷化劑化療之前獲取睪丸活檢樣本。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><u>放射線可通過直接損傷睪丸生殖細(xì)胞、支持生精作用的支持細(xì)胞和產(chǎn)生睪酮的間質(zhì)細(xì)胞而阻礙精子發(fā)生</u><i style="font-size: 15px;">（Kenney et al., 2012; Stukenborg et al., 2018b）</i>。分化的精原細(xì)胞對(duì)低至0.1 Gy的散射劑量敏感，導(dǎo)致短期內(nèi)生精停滯<i style="font-size: 15px;">（Rowley et al., 1974）</i>。2-3 Gy的劑量也會(huì)影響SSCs，并引起長(zhǎng)期無精癥。<u style="color: rgb(237, 35, 8);">超過6 Gy</u>的劑量會(huì)耗盡SSCs儲(chǔ)備并導(dǎo)致永久性不育<i style="font-size: 15px;">（Rowley et al., 1974; Centola et al., 1994）</i>。眾所周知，即使很小劑量的放射線也常常會(huì)引起急性損傷，且并不一定會(huì)恢復(fù)。因此，任何劑量的睪丸放療都應(yīng)被認(rèn)為可能增加生精能力受損的風(fēng)險(xiǎn)<i style="font-size: 15px;">（Skinner et al., 2017）</i>。有報(bào)道提示<u>造血干細(xì)胞移植</u>（HSCT）患者處于青春期是成年睪丸體積的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子<i style="font-size: 15px;">（Wilhelmsson et al., 2014）</i>，而這主要取決于支持細(xì)胞的數(shù)量<i style="font-size: 15px;">（Sharpe et al., 2003）</i>。與青春期內(nèi)或之后的相同療法相比，在青春期前為準(zhǔn)備HSCT而對(duì)患者進(jìn)行的全身照射（全身放療10-12 Gy）會(huì)導(dǎo)致成年睪丸體積明顯減小<i style="font-size: 15px;">（Wilhelmsson et al., 2014）</i>。這些發(fā)現(xiàn)為癌癥治療對(duì)支持細(xì)胞群的影響提供了證據(jù)。有多項(xiàng)研究表明，睪丸放療劑量≥21–24 Gy（其中大多數(shù)≥12Gy，包括全身放療）可能與導(dǎo)致睪丸激素缺乏的間質(zhì)細(xì)胞衰竭風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)<i style="font-size: 15px;">（Skinner et al., 2017）</i>。<u>化療導(dǎo)致的間質(zhì)細(xì)胞衰竭則相對(duì)較少</u><i style="font-size: 15px;">（Sklar, 1999）</i>。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block">哪些患者存在生育能力喪失的風(fēng)險(xiǎn)？選擇能夠受益于此治療的患者對(duì)于成功進(jìn)行生育保護(hù)至關(guān)重要。由于手術(shù)切取睪丸組織是一種有創(chuàng)性手段，并且利用這些組織恢復(fù)生育能力的方法仍處于實(shí)驗(yàn)階段，所以睪丸組織凍存庫的納入標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)優(yōu)選那些有較大風(fēng)險(xiǎn)面臨治療引起睪丸損傷和繼發(fā)不育的患者。不同中心對(duì)于青春期前和青春期男性患者的睪丸組織凍存納入標(biāo)準(zhǔn)有所不同 （Wyns et al., 2011；Picton et al., 2015）。在一些治療中心，睪丸組織庫僅限于以前未接受過任何治療的患者 （Wyns et al., 2011），但另一些治療中心還納入了已經(jīng)接受過化療或放療的患者 （Stukenborg et al., 2018a; Valli-Pulaski et al., 2019; Braye et al., 2019)。大多數(shù)睪丸組織庫是針對(duì)患有癌癥的青春期前男性，并且主要是針對(duì)睪丸癌、霍奇金/非霍奇金惡性淋巴瘤和實(shí)體腫瘤治療前的患者（Picton et al., 2015）。睪丸組織凍存已在因計(jì)劃或近期開始治療而面臨極高不育風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤患者中開展，也可用于面臨遺傳因素所致睪丸退變風(fēng)險(xiǎn)的患者。接受包括異體/自體HSCT或睪丸照射治療的患者與較高的不育風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，而抗代謝類藥物、長(zhǎng)春堿類、鬼臼毒素類和抗腫瘤類抗生素等一線化療與較低的不育風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此，大多數(shù)兒童期癌癥患者在確診時(shí)并未達(dá)到生育力顯著受損風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。然而，疾病療效不佳或復(fù)發(fā)可能導(dǎo)致患者被重新給予新的治療方案，而這些治療方案可能導(dǎo)致不育 （Jahnukainen et al., 2015）。這意味著在試圖保存生育力時(shí)，許多癌癥患者已經(jīng)接受過化療，這可能會(huì)降低凍存組織的質(zhì)量。另一方面，如果只有未經(jīng)治療的患者才有資格保留生育能力，雖然能提高冷凍保存組織的質(zhì)量，但是這意味著要為大量患者（如果不限于高危人群）進(jìn)行睪丸活檢，而其中的很多人可能并不會(huì)不育。此外，這也意味著復(fù)發(fā)的患者不符合睪丸組織凍存的標(biāo)準(zhǔn)，即便他們的SSCs細(xì)胞群可能并未受到先前治療的影響。因此，根據(jù)已發(fā)表的參考文獻(xiàn)(Masliukaite et al., 2016)，使用非烷化藥物治療且SSCs群在正常范圍內(nèi)的患者，如發(fā)生復(fù)發(fā)應(yīng)在首次治療后獲得保留生育能力的機(jī)會(huì)（Poganitsch-Korhonen et al., 2017; Stukenborg et al., 2018a）。然而，在化療期間或之后不久凍存的生殖細(xì)胞質(zhì)量可能在理論上受到影響，需要進(jìn)一步研究以詳細(xì)闡明潛在的損傷。同種異體造血干細(xì)胞移植是骨髓衰竭地中海貧血鐮狀細(xì)胞病和許多其他遺傳性疾病患者的治愈方法。其結(jié)果是越來越多的患有此類非惡性疾病的兒童有可能因?yàn)橹委煻鴨适芰?。早期研究記錄了接受低?qiáng)度移植前照射的兒童自發(fā)進(jìn)入青春期（Panasiuk et al., 2015），但目前關(guān)于其對(duì)生育潛能影響的數(shù)據(jù)有限。這些研究表明，HSCT或長(zhǎng)期使用羥基脲治療鐮狀細(xì)胞病后出現(xiàn)無精子癥的風(fēng)險(xiǎn)為50％（Lukusa et al., 2009）。因此，在該患者群體中也需要保存睪丸組織。由于在單基因突變的非惡性疾?。ㄖ饕堑刂泻Ｘ氀?，范可尼貧血和由FOXP3基因變異引起的免疫缺陷）中精原細(xì)胞數(shù)量也有減少（Stukenborg et al., 2018）。原發(fā)疾病也可能影響性腺功能或增加對(duì)后續(xù)治療毒性的敏感性。根據(jù)這一證據(jù)，需要進(jìn)行更多的研究來了解與治療和患者相關(guān)的影響生育力保存的因素。這將優(yōu)化患者篩選和睪丸活檢的時(shí)機(jī)。Klinefelter綜合征患者在發(fā)育過程中面臨生殖細(xì)胞衰竭，因此超過90％病例出現(xiàn)無精子癥（Franik et al., 2016; Van Saen et al., 2018）。在某些治療中心，對(duì)青少年克氏綜合征患者進(jìn)行睪丸活檢標(biāo)本凍存是生育力保存項(xiàng)目的一部分（Heckmann et al., 2018; Rives et al., 2018; Van Saen et al., 2018）。然而，由于SSCs在幼齡（<4歲）就喪失了，是否應(yīng)該為青春期前Klinefelter綜合征患者提供生育力保存的問題仍然存在較大爭(zhēng)議。</p> <p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">青春期前男性的生育力保存：臨床實(shí)踐現(xiàn)狀</b></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b><u>生育力保存的管理</u></b></p><p class="ql-block">癌癥患者時(shí)間限制性以及醫(yī)護(hù)人員缺乏不育風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)知識(shí)，是目前腫瘤患者進(jìn)行生育力保存的主要障礙。因此，在此領(lǐng)域進(jìn)行適當(dāng)而有效的生育力保存管理，需要一支由訓(xùn)練有素的醫(yī)師、護(hù)士、心理醫(yī)學(xué)專家組成的團(tuán)隊(duì)（圖1）。理想狀態(tài)下，團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)該包括腫瘤學(xué)以及生殖醫(yī)學(xué)專家，以便對(duì)每位患者所面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行全面的評(píng)估。采取<u>多學(xué)科協(xié)作護(hù)理路徑（Multi-collaborative care pathways, MCCPs）</u>，包括對(duì)相關(guān)知識(shí)十分熟悉的醫(yī)護(hù)人員，以及腫瘤學(xué)專家及生殖醫(yī)學(xué)專家加強(qiáng)溝通，能夠促進(jìn)患者確診時(shí)共識(shí)的達(dá)成，也能增加患者轉(zhuǎn)診的數(shù)量及對(duì)整個(gè)流程的接受程度。一項(xiàng)小規(guī)模的研究表明，對(duì)于男性兒童患者，在進(jìn)行腫瘤診斷時(shí)接受面對(duì)面咨詢的患者，對(duì)生育力保存的接受度最高<i style="font-size: 15px;">（Ginsberg et al., 2010）</i>，這一結(jié)論在一項(xiàng)更大樣本量的基于良性及惡性血液病患者的研究中得到了進(jìn)一步證實(shí)（74%患者為＜12歲的男性）<i style="font-size: 15px;">(Wyns et al., 2015)</i>。多學(xué)科協(xié)作護(hù)理路徑可以對(duì)腫瘤科醫(yī)生提供幫助，以便他們能及時(shí)給患者實(shí)施生育力保存措施，并能提供合理的護(hù)理幫助和兒童心理咨詢，這樣更容易在腫瘤確診時(shí)獲得患者及家長(zhǎng)的支持。因此多學(xué)科協(xié)作護(hù)理路徑實(shí)施的過程中，最重要的是必須選定并培訓(xùn)關(guān)鍵工作人員，使其能夠開展腫瘤患者生育力保存策略方面的探討，并能提供清晰的轉(zhuǎn)診途徑，以促進(jìn)兒童腫瘤中對(duì)生育問題相關(guān)的討論 <i style="font-size: 15px;">(Armuand et al., 2017)</i>。與患兒及父母的談話也被證實(shí)是知情決策的關(guān)鍵<i style="font-size: 15px;">(Nagel and Neal,2008; Carlson et al., 2017)</i>。談話的重點(diǎn)不僅要告知全面及容易理解的實(shí)驗(yàn)性治療策略，也需要著重強(qiáng)調(diào)患者將來能夠生育子代的希望，這對(duì)患者做出合理的決定有積極意義。當(dāng)然，患者及父母必須對(duì)生育力保存的實(shí)驗(yàn)性質(zhì)充分知情。此外，生育力保存實(shí)施的過程中，強(qiáng)烈推薦向患者提供一些相關(guān)的宣教資料<i style="font-size: 15px;">(Vadaparampil et al., 2008)</i>。這些向患者提供的告知及輔助決策的宣教材料，內(nèi)容應(yīng)與患者的年齡匹配，并提供多種語言的版本<i style="font-size: 15px;">(Rodriguez-Wallberg et al., 2019)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">對(duì)每一位患者都應(yīng)該提供個(gè)體化的管理。因此，除了提供特定疾病的專業(yè)護(hù)理以外，醫(yī)務(wù)人員必須清楚青春期前及圍青春期性激素和睪丸的生理變化，因?yàn)檫@對(duì)于給患者/家屬提供準(zhǔn)確信息以選擇凍存配子或性腺組織而言十分重要。特別是針對(duì)圍青春期的男性更重要，因?yàn)閱伪扼w的精子細(xì)胞和/或成熟精子可能在睪丸中已經(jīng)出現(xiàn)（此時(shí)精液中可能無法檢測(cè)到精子）<i style="font-size: 15px;"> (Wyns et al.,2011)</i>。鑒于保存成熟精子的流程與保存包含精原干細(xì)胞的睪丸組織不同，應(yīng)制定旨在盡可能地優(yōu)先保存睪丸精子而非睪丸組織的機(jī)構(gòu)指南<i style="font-size: 15px;">(Picton et al., 2015)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">需要接受生殖毒性藥物治療的患者在開始接受治療之前需要找生殖醫(yī)學(xué)專家進(jìn)行咨詢<i style="font-size: 15px;">(Redig et al.,2011)</i>。然而，在實(shí)際臨床工作中發(fā)現(xiàn)，部分患者和/或父母或者監(jiān)護(hù)人在化療開始之后才要求進(jìn)行生育力保存<i style="font-size: 15px;">(Abofoul-Azab et al., 2018)</i>。此外，盡管腫瘤治療仍然是疾病治療中優(yōu)先考慮的，但應(yīng)盡可能考慮并討論生育力保存。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">為了在生育力保存領(lǐng)域建立進(jìn)一步的指導(dǎo)方針，建議將參與生育力保存的患者納入系統(tǒng)的長(zhǎng)期隨訪中<i style="font-size: 15px;">（Melan et al.，2018）</i>。重要的是，我們要告知患兒及其父母，截至目前冷凍睪丸組織仍處于實(shí)驗(yàn)性研究階段。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">考慮到存在獲取醫(yī)療資源不對(duì)等的問題，除了在醫(yī)院范圍內(nèi)的MCCP之外，在不同醫(yī)院之間建立結(jié)構(gòu)化網(wǎng)絡(luò)也是優(yōu)化管理生育力保存的重要步驟。盡管腫瘤治療應(yīng)優(yōu)先于生育力保存，但在腫瘤治療過程中任何必要的時(shí)候都應(yīng)該討論和考慮生育力及其保存措施。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b><u>生育力保存流程</u></b></p><p class="ql-block"><u>圍青春期男性患兒理論上可以通過手淫取精，進(jìn)行精子冷凍。</u>然而有些患兒可能會(huì)出現(xiàn)手淫取精失敗，或者拒絕手淫取精，或者精液結(jié)果提示重度少精子癥、無精子癥、死精子癥<i style="font-size: 15px;">(Safsaf et al., 2011; Daudin et al., 2015)</i>，這種情況下應(yīng)該考慮進(jìn)行睪丸穿刺取精，如果穿刺取精成功也可以進(jìn)行精子冷凍。如果睪丸穿刺未能獲得精子，可以考慮對(duì)睪丸穿刺所得睪丸組織進(jìn)行凍存，目的是保存睪丸組織內(nèi)的精原干細(xì)胞。鑒于腫瘤治療開始后，精子的產(chǎn)生會(huì)長(zhǎng)時(shí)間停滯<i style="font-size: 15px;">(Schrader et al., 2001)</i>，建議在進(jìn)行有生殖毒性的藥物治療之前完成生育力保存，同時(shí)要避免化療和放療對(duì)生殖細(xì)胞核的致突變作用，以及采用患者精子進(jìn)行輔助生殖技術(shù)治療時(shí)，對(duì)胚胎的潛在危害（流產(chǎn)、畸形、染色體或基因異常）<i style="font-size: 15px;">(Foresta et al., 2000; Picton et al., 2015)</i>。凍存的精子可用于IUI或者IVF（常規(guī)IVF 或ICSI）治療，這取決于精子復(fù)融以后的濃度及活力。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">對(duì)于尚未產(chǎn)生精子的青春期前男性患兒，以及在低劑量生殖毒性治療（化療或放療）前沒有凍存精子的圍青春期男性患兒，<u>以保存精原干細(xì)胞為目的的睪丸組織冷凍</u>是一個(gè)可以接受的方案(Picton et al., 2015)。<u>進(jìn)行睪丸組織凍存前建議行單側(cè)睪丸活檢</u>，活檢的方法要符合當(dāng)?shù)氐牟僮饕?guī)范。睪丸組織取出后應(yīng)立即置于4-8℃的轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中，并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，以盡可能減少熱缺血時(shí)間以及微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。在外科手術(shù)室距離實(shí)驗(yàn)室比較遠(yuǎn)的情況下，睪丸組織最多可以在4℃的特殊培養(yǎng)基中(DMEM/F12) 中保存3天<i style="font-size: 15px;">(Faes and Goossens, 2016, 2017)</i>。<u>睪丸組織可以制備成細(xì)胞懸液進(jìn)行凍存，也可以直接冷凍睪丸組織以凍存精原干細(xì)胞。</u>睪丸組織塊的冷凍保存保留了將來進(jìn)行細(xì)胞治療或組織治療的機(jī)會(huì)。將每塊睪丸組織切成小塊，然后將其置入含有冷凍保護(hù)劑的冷凍管中<i style="font-size: 15px;">（Rives et al.,2013）</i>。目前，就能夠產(chǎn)生精子的最佳冷凍保存技術(shù)或生育力恢復(fù)程序而言，尚未建立用于人類睪丸組織冷凍的標(biāo)準(zhǔn)化方案，<u>最常用的冷凍方案是程序化慢速冷凍</u><i style="font-size: 15px;">(Keros et al., 2005; Keros et al., 2007;Wyns et al., 2007;Curaba et al., 2011; Babayev et al., 2013; Poels et al., 2013; Ginsberg et al., 2014; Pietzak 3rd et al., 2015; Ho et al., 2017; Valli-Pulaski et al., 2019)</i>。目前在大多數(shù)慢速冷凍方案中使用的冷凍保護(hù)劑是二甲基亞砜<i style="font-size: 15px;">（Keros et al., 2005）</i>，這種滲透性的冷凍保護(hù)劑在保護(hù)細(xì)胞活力方面已被證明優(yōu)于1,2-丙二醇和甘油 <i style="font-size: 15px;">(Keros et al., 2007, Wyns et al., 2007, Wyns et al., 2008, Curaba et al., 2011, Wyns et al., 2011, Babayev et al., 2013, Baert et al.,2013, Poels et al., 2013, Ginsberg et al., 2014, Pietzak et al., 2015, Ho et al., 2017)</i>。冷凍培養(yǎng)基中也添加了非滲透性的冷凍保護(hù)劑蔗糖<i style="font-size: 15px;">(Wyns et al., 2007; Wyns et al., 2008; Curaba et al., 2011; Wyns et al., 2011; Babayev et al., 2013;Baert et al., 2013; Poels et al., 2013; Ginsberg et al., 2014; Ho et al.,2017)</i>。一些基于小樣本人群的研究報(bào)道了睪丸組織的玻璃化冷凍技術(shù)（如超快速冷凍），然而目前尚無證據(jù)表明其在組織和細(xì)胞完好性方面優(yōu)于慢速冷凍 <i style="font-size: 15px;">(Curaba et al., 2011; Baert et al., 2013; Poels et al., 2013)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block" style="text-align: center;"><span style="color: rgb(237, 35, 8);">圖1 青春期前男性患者生育力保存多學(xué)科協(xié)作途徑示意圖</span></p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block">睪丸組織冷凍保存患者的隨訪對(duì)睪丸組織凍存的患者進(jìn)行隨訪的目的包括：確定該類患者行睪丸活檢后的短期和長(zhǎng)期并發(fā)癥；明確性腺毒性治療對(duì)隨后的生殖功能和生育力的潛在影響；根據(jù)患者的診斷和所接受的治療不斷地對(duì)其生育風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分層評(píng)估，以調(diào)整未來患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)；告知患者及其家屬本領(lǐng)域的發(fā)展和進(jìn)步，這可能使他們?cè)谖磥砟軌蚴褂米泽w組織達(dá)到生育子代的目的。睪丸活檢的并發(fā)癥睪丸活檢可被視為是一種風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低的操作。通過與其他必要的干預(yù)措施如中心靜脈導(dǎo)管置入、骨髓穿刺或診斷性腰椎穿刺的結(jié)合，可以最大限度地減少麻醉的頻率和次數(shù)（Anderson et al）。然而，對(duì)于要保存生育力的特定患者群體，可能存在與其基礎(chǔ)疾病或治療相關(guān)的潛在并發(fā)癥。比如，對(duì)于接受化療和放療的患者，或患有骨髓抑制相關(guān)疾?。ㄈ缭偕系K性貧血）的患者，可能會(huì)增加出血和感染風(fēng)險(xiǎn)。這些風(fēng)險(xiǎn)可以通過準(zhǔn)確識(shí)別血小板減少癥和中性粒細(xì)胞減少癥以及輸注血小板來控制。術(shù)后還需要仔細(xì)觀察患者手術(shù)切口愈合情況及其臨床表現(xiàn)，一旦出現(xiàn)感染需要及時(shí)進(jìn)行抗生素治療。目前僅少數(shù)研究報(bào)道了為保存生育力而行睪丸活檢的術(shù)中和短期并發(fā)癥的發(fā)生率。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，總的并發(fā)癥發(fā)生率約2-3%（Ginsberg et al., 2014; Ho et al.,2017; Uijldert et al., 2017; Ming et al., 2018; Valli-Pulaski et al., 2019)。這些并發(fā)癥包括睪丸或手術(shù)傷口的感染，其中包括一例傷口開裂的報(bào)道。疼痛也是睪丸活檢的一個(gè)重要并發(fā)癥，應(yīng)在術(shù)后定期評(píng)估，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)逆?zhèn)痛治療。雖然目前的數(shù)據(jù)表明，以保留生育力為目的的睪丸活檢是一種低風(fēng)險(xiǎn)手術(shù)，但關(guān)于術(shù)后并發(fā)癥的更多研究數(shù)據(jù)，以及制定標(biāo)準(zhǔn)化的術(shù)前、圍術(shù)期和術(shù)后患者管理指南，仍需我們進(jìn)一步探索和研究。雖然獲得睪丸組織以保存生育力是睪丸活檢的首要目標(biāo)，但我們需同時(shí)確保手術(shù)本身不會(huì)進(jìn)一步損害這些患者的睪丸功能。因此，目前研究的一個(gè)重要方向就是對(duì)已進(jìn)行生育力保存的患者的睪丸功能開展從幼年時(shí)期、青春期到成年的隨訪。到目前為止，僅有一項(xiàng)研究報(bào)道了睪丸活檢術(shù)后影響的中期隨訪結(jié)果（Uijldert et al., 2017)。這項(xiàng)前瞻性研究對(duì)64例男性患兒進(jìn)行超聲檢查，以確定活檢后的睪丸體積，并與對(duì)側(cè)未活檢的睪丸進(jìn)行比較。研究者發(fā)現(xiàn)盡管術(shù)后早期雙側(cè)睪丸體積均有萎縮的現(xiàn)象，但在隨后的6個(gè)月和12個(gè)月的隨訪中，沒有觀察到活檢后的睪丸和未活檢的睪丸體積之間的差異，除了在隨訪12個(gè)月后有一小部分患者（6%）活檢的一側(cè)睪丸有纖維化的征象 （Uijldert et al., 2017)。這些患者在進(jìn)行睪丸活檢時(shí)睪丸體積還處在青春期前的狀態(tài)（< 4ml）。由于睪丸體積在青春期前不會(huì)明顯增長(zhǎng)，因此后續(xù)的研究需要關(guān)注睪丸活檢對(duì)青春期睪丸增長(zhǎng)和成人睪丸體積的長(zhǎng)期影響。另外，此類隨訪評(píng)估還需要考慮到活檢和性腺毒性療法的綜合影響。</p> <p class="ql-block"><b><u>睪丸組織活檢冷凍保存后的生育功能評(píng)估</u></b></p><p class="ql-block">有必要對(duì)每位患者進(jìn)行隨訪，目的在于確保青春期的啟動(dòng)和正常發(fā)育。這對(duì)于評(píng)估第二性征的發(fā)育，確保睪酮分泌并維持至成年和生育子代都非常重要。青春期發(fā)育狀況可以通過Tanner分期和測(cè)量睪丸體積進(jìn)行評(píng)估，而對(duì)于高危人群應(yīng)在<u>不晚于12歲開始監(jiān)測(cè) </u><i style="font-size: 15px;">(Skinner et al., 2017)</i>。黃體生成素(LH) 刺激Leydig細(xì)胞產(chǎn)生睪酮是青春期第二性征發(fā)育和成年后精子發(fā)生的必要條件，雖然在兒童時(shí)期接受過抗腫瘤治療的患者，青春期和成年后的LH和睪酮分泌通常不受干擾，但由于原發(fā)性性腺損傷，其生育力仍可能受到影響<i style="font-size: 15px;">(Stukenborg et al., 2018b)</i>。血清卵泡刺激素（FSH）升高通常表明睪丸支持細(xì)胞功能障礙以及精子發(fā)生受損 <i style="font-size: 15px;">(Kelsey et al., 2017)</i>。青春期后的生育力也可以通過測(cè)量睪丸體積、血清促性腺激素水平或精液分析來評(píng)估<i style="font-size: 15px;">(Skinner et al., 2017)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b><u>睪丸組織冷凍保存患者選擇標(biāo)準(zhǔn)的調(diào)整</u></b></p><p class="ql-block">隨訪的另一重要意義在于驗(yàn)證并在必要時(shí)調(diào)整睪丸組織冷凍保存患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)。這樣既防止那些仍擁有自然生育能力的患者進(jìn)行不必要的手術(shù)，同時(shí)確保那些可能獲益的患者能進(jìn)行手術(shù)干預(yù)。這種方式已經(jīng)成功應(yīng)用于卵巢組織冷凍保存，這也就印證了目前的選擇標(biāo)準(zhǔn)可以較準(zhǔn)確地識(shí)別存在卵巢早衰（POF）風(fēng)險(xiǎn)的人群 <i style="font-size: 15px;">(Wallace et al., 2014)</i>。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行卵巢組織冷凍保存的患者中有30%發(fā)生了POF，而未進(jìn)行生育力保存的患者則沒有發(fā)生POF。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">對(duì)男性采取類似的方式則需要對(duì)促性腺激素和精液分析進(jìn)行連續(xù)性的隨訪，并對(duì)接受和未接受睪丸活檢的患者進(jìn)行比較。然而，對(duì)于這些患者的隨訪，尤其是對(duì)沒有考慮過生育力保存的患者具有一定難度。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b><u>關(guān)于睪丸組織冷凍保存患者隨訪的建議</u></b></p><p class="ql-block">基于目前的研究數(shù)據(jù)和對(duì)進(jìn)一步研究的需求，我們認(rèn)為青春期前的患者在接受存在潛在性腺毒性治療前，應(yīng)定期接受兒科內(nèi)分泌醫(yī)師、男科醫(yī)師或泌尿科醫(yī)師對(duì)其生殖功能的評(píng)估。生殖功能的評(píng)估應(yīng)該包括青春期發(fā)育分期，睪丸體積測(cè)量（利用睪丸測(cè)量計(jì)或超聲）以及相關(guān)的血清促性腺激素檢測(cè)。也可考慮評(píng)估基線睪丸支持細(xì)胞的功能（抗繆勒管激素和抑制素B）。對(duì)于青春期前的患者治療后的隨訪，一種實(shí)用的方法是不定期（每1-2年）進(jìn)行睪丸體積和促性腺激素水平的評(píng)估。研究者認(rèn)為，患者從12歲開始，應(yīng)該至少每年評(píng)估一次青春期的發(fā)育狀態(tài)，包括Tanner分期和睪丸體積測(cè)量<i style="font-size: 15px;">(Skinner et al., 2017)</i>。對(duì)促性腺激素和睪酮的評(píng)估和測(cè)定也可以作為青春期常規(guī)評(píng)估的一部分，以確保在必要時(shí)對(duì)青春期延遲進(jìn)行治療。青春期延遲可能是由高促性腺激素性性功能減退癥引起的（高濃度促性腺激素和睪丸體積?。?，提示存在原發(fā)性性腺功能衰竭。除此之外，低促性腺激素性性腺功能減退癥也可能是青春期延遲的一個(gè)重要原因。<u>對(duì)于青春期延遲的男性患兒（14歲時(shí)睪丸體積小于3 ml）</u>，利用睪酮誘導(dǎo)青春期發(fā)育的目的在于啟動(dòng)和維持其第二性征的發(fā)育，最好能達(dá)到和同齡人一致的水平。成年期生育力的評(píng)估包括睪丸體積、血清促性腺激素和睪酮水平的測(cè)定，以及精液分析<i style="font-size: 15px;">(Skinner et al., 2017)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">關(guān)于歐洲和美國未性成熟的睪丸組織冷凍保存中心的調(diào)查報(bào)告</b></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">2012年，首次報(bào)告了針對(duì)歐洲和以色列提供未性成熟的睪丸組織冷凍保存的中心的調(diào)查<i style="font-size: 15px;">（Picton et al., 2015）</i>。在該次調(diào)查中共納入了七個(gè)醫(yī)學(xué)中心的調(diào)查結(jié)果。為了明確男性生育力保存領(lǐng)域的最新進(jìn)展，研究機(jī)構(gòu)使用了由歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì) (ESHRE) 的男科學(xué)組 (SIG Andrology) 及生育力保存學(xué)組 (SIG Fertility Preservation) 編制的擴(kuò)展問卷再次進(jìn)行了調(diào)查。調(diào)查問卷共發(fā)給歐洲和美國的22名聯(lián)系人，最終收到17名聯(lián)系人的答復(fù)。調(diào)查數(shù)據(jù)包含了24個(gè)提供冷凍保存未性成熟的睪丸組織以保存生育力的站點(diǎn)（其中一些站點(diǎn)是某個(gè)協(xié)作網(wǎng)絡(luò)的一部分）的信息。其余5名中的4名聯(lián)系人表示，他們確實(shí)參與了收集樣本進(jìn)行冷凍保存的工作，但他們的數(shù)據(jù)是由一個(gè)協(xié)調(diào)中心進(jìn)行報(bào)告的，而有1名聯(lián)系人已不在提供睪丸組織冷凍保存的診所服務(wù)。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">這24個(gè)地點(diǎn)分別位于歐洲（斯堪的納維亞、冰島、英國、比利時(shí)、荷蘭、法國、西班牙、德國）、美國、以色列和約旦。值得注意的是，一些協(xié)調(diào)中心在國家甚至國際網(wǎng)絡(luò)的框架內(nèi)向一些合作診所提供未性成熟的睪丸組織的冷凍保存。例如在Nordfertil協(xié)作網(wǎng)絡(luò)下，從芬蘭、冰島和瑞典的診所獲取睪丸組織，隨后分別集中儲(chǔ)存在赫爾辛基大學(xué)醫(yī)院和卡羅林斯卡學(xué)院及卡羅林斯卡大學(xué)醫(yī)院。在英國則是在愛丁堡和牛津存儲(chǔ)樣本，而僅在愛丁堡對(duì)共享樣本進(jìn)行研究。德國Androprotect網(wǎng)絡(luò)目前由三個(gè)診所組成，這三個(gè)德國診所作為獲取睪丸組織的站點(diǎn)，而明斯特大學(xué)診所則是儲(chǔ)存冷凍保存樣本的中心站點(diǎn)。最后，如最近發(fā)表的文章<i style="font-size: 15px;">（Valli-Pulaski et al., 2019）</i>所示，由11個(gè)國際站點(diǎn)組成的北美網(wǎng)絡(luò)已將樣本集中在匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行冷凍保存。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">令人印象深刻的是，在2012年最后一次調(diào)查時(shí)，冷凍保存睪丸組織的樣本數(shù)約為260例，而在2019年的調(diào)查中，樣本數(shù)量達(dá)1033例，較前增長(zhǎng)了4倍<span style="color: rgb(237, 35, 8);">（見表1）</span>。這個(gè)數(shù)字是在最近一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告中預(yù)測(cè)世界范圍內(nèi)約有700例冷凍保存睪丸組織樣本的基礎(chǔ)上的總和<i style="font-size: 15px;">(Valli-Pulaski et al., 2019)</i>，這表明了生育力保存策略的推廣和接受程度越來越高。這一進(jìn)步還體現(xiàn)在至少有一半的協(xié)調(diào)中心收集和儲(chǔ)存組織的費(fèi)用是由醫(yī)療系統(tǒng)部分承擔(dān)的。這是一個(gè)相當(dāng)大的進(jìn)步，因?yàn)楦鶕?jù)2012年的調(diào)查<i style="font-size: 15px;">(Picton et al., 2015)</i>，這些費(fèi)用是由醫(yī)院和研究基金（6個(gè)中心）甚至由患者（1個(gè)中心）承擔(dān)的。表1提供了2019年問卷調(diào)查結(jié)果的概述。</p><p class="ql-block">與2012年的調(diào)查一致，接受睪丸活檢保存生育力的患者年齡從幾個(gè)月到18歲不等。有趣的是，目前存儲(chǔ)的樣本數(shù)量與接受睪丸組織活檢的患者數(shù)量幾乎相同。考慮到這些樣本尚未用于恢復(fù)生育力，因此這表明被丟棄的樣本較少。丟棄樣本的一個(gè)潛在原因是患者死亡。盡管有些站點(diǎn)允許繼續(xù)使用這些樣本進(jìn)行研究，但在其他站點(diǎn)，<u>組織樣本在患者死亡后必須丟棄</u>。不過，在患者或家長(zhǎng)知情同意后，睪丸組織是可以捐獻(xiàn)給研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行研究的。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">近7年來，尋求生育力保存的患者群體發(fā)生了一個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)變化。2012年，大多數(shù)中心僅儲(chǔ)存腫瘤治療前患者的睪丸組織，而僅有4個(gè)中心冷凍保存了存在生殖細(xì)胞丟失風(fēng)險(xiǎn)的非惡性疾病患者的睪丸組織<i style="font-size: 15px;">(Picton et al., 2015)</i>。而2019年，所有協(xié)調(diào)中心均表示，他們也可冷凍保存非惡性疾病患者的睪丸組織。此外，值得注意的是，非惡性疾病患者的睪丸組織冷凍保存的比例從2％到91％不等，而在已有的4個(gè)冷凍保存點(diǎn)中，這一患者群體占比達(dá)50％以上。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">隨著這一進(jìn)展，男性睪丸組織冷凍保存庫的適應(yīng)證中所提及的疾病種類也變得更加多樣化，特別是非惡性疾病的種類<span style="color: rgb(237, 35, 8);">(圖2A至圖2C)</span>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"> 1033例進(jìn)行睪丸活檢患者中有1015例提供了臨床資料，這些患者的診斷可分為惡性疾病(n=630)、非惡性疾病(n=280) 和非血液學(xué)遺傳異常(包括性腺發(fā)育不良綜合征和性發(fā)育障礙；n=105)。在這三個(gè)類別中可進(jìn)一步識(shí)別出最為常見的疾病。在惡性疾病中，血液系統(tǒng)疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是最常見的疾病，而在非惡性疾病和遺傳性疾病中，鐮狀細(xì)胞病和Klinefelter綜合征分別是最常見的生育力保存指征<span style="color: rgb(237, 35, 8);">(圖2A至圖2C)</span>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">問卷還詢問了有關(guān)冷凍保存睪丸組織的法律限制，這些限制在知情同意書中有所規(guī)定。雖然大多數(shù)站點(diǎn)對(duì)最長(zhǎng)存儲(chǔ)時(shí)間沒有任何具體限制，但個(gè)別網(wǎng)站明確要求每年必須與患者父母或患者本人（年滿18歲后）進(jìn)行聯(lián)系。各個(gè)站點(diǎn)均未報(bào)告采取生育力保存措施的最低年齡要求。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">最后，所有站點(diǎn)均表示，睪丸組織被認(rèn)定是組織而不是配子，這對(duì)法律規(guī)定也會(huì)有所影響，其中包括報(bào)銷和儲(chǔ)存的費(fèi)用。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block" style="text-align: center;"><span style="color: rgb(237, 35, 8);">表1 根據(jù)歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)的男科學(xué)組及生育力保存學(xué)組編制的調(diào)查問卷結(jié)果匯總</span></p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block" style="text-align: center;"><span style="color: rgb(237, 35, 8);">圖 2 冷凍保存的睪丸組織樣本的分類和比例。</span></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><br></p><h5><span style="color: inherit;">圖中展示數(shù)據(jù)： (A) 惡性疾病患者（n=630，以癌癥治療作為生育力保存的適應(yīng)證）；(B) 非惡性疾病患者（n=280，以造血干細(xì)胞移植作為生育力保存的適應(yīng)證）；(C) 生殖器異常、睪丸病變或性功能障礙患者（n=105，以睪丸病變或存在患睪丸病變風(fēng)險(xiǎn)作為生育力保存的適應(yīng)證）。</span></h5><h5><span style="color: inherit;">CNS = central nervous system，中樞神經(jīng)系統(tǒng)；FP= fertility preservation，生育力保存；HSCT= hematopoietic stem cell transplantation，造血干細(xì)胞移植；NOA= non-obstructive azoospermia，非梗阻性無精子癥。</span></h5><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">生育力恢復(fù):未來的選擇</b></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">雖然世界各地的許多醫(yī)療中心己有針對(duì)青春期前男性生育力保護(hù)的方案，但利用冷凍保存的睪丸組織恢復(fù)生育能力的方法仍在探索中。目前研究主要集中在三個(gè)方面：精原干細(xì)胞增殖與自體移植，睪丸組織自體移植和體外誘導(dǎo)精子發(fā)生。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b><u>精原干細(xì)胞增殖和自體移植</u></b></p><p class="ql-block">經(jīng)體外增殖后的精原干細(xì)胞通過自體移植經(jīng)睪丸網(wǎng)到生精小管中被認(rèn)為是唯一有可能通過自然受孕恢復(fù)生育能力而獲得子代的方法。簡(jiǎn)而言之，未來臨床細(xì)胞治療計(jì)劃將包含從冷凍保存的睪丸組織中分離出睪丸細(xì)胞，并經(jīng)體外培養(yǎng)增殖得到精原干細(xì)胞亞群。隨后，這些增殖的精原干細(xì)胞將通過自體移植到由于治療所致不育的兒童癌癥幸存者睪丸中。移植后，精原干細(xì)胞將定植于睪丸，進(jìn)行精子發(fā)生，并持續(xù)提供精子發(fā)生從而實(shí)現(xiàn)自然受孕<i style="font-size: 15px;">(Brinster，2007)</i>。1994年，精原干細(xì)胞移植后引起精子發(fā)生的概念首次在小鼠模型中成功證實(shí)<i style="font-size: 15px;">(Brinster和Zimmermann，1994)</i>，同時(shí)也在其他動(dòng)物模型中得以驗(yàn)證，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(Hermann et al，2012)：后者證明了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物精原干細(xì)胞移植后可定植的原理<i style="font-size: 15px;">(Schlatt et al，1999)</i>，并成功利用移植的精原干細(xì)胞發(fā)育為精子<i style="font-size: 15px;">（Hermann et al，2012)</i>。通過分離人尸體的睪丸組織使該方法得以重現(xiàn)并進(jìn)一步優(yōu)化<i style="font-size: 15px;">(Ning et al，2012；Faes et al，2013；Faes et al，2017)</i>。有趣的是，在小鼠模型中成功地實(shí)現(xiàn)了精原干細(xì)胞移植后的自然受孕，并獲得了兩代健康后代，其后代一般發(fā)育正常，未見染色體數(shù)目異?；虮碛^遺傳標(biāo)記異常<i style="font-size: 15px;">(Goossens et al，2009；Goossens et al，2010)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><u>由于青春期前睪丸組織活檢中精原干細(xì)胞數(shù)量有限，精原干細(xì)胞的增殖成為精原干細(xì)胞自體移植成功應(yīng)用于臨床的必要條件</u>。2003年首次在小鼠模型中建立了能長(zhǎng)期增殖精原干細(xì)胞模型<i style="font-size: 15px;">（Kanatsu-Shinohara et al，2003)</i>。即使在體外經(jīng)過長(zhǎng)期（2年）培養(yǎng)，這些小鼠精原干細(xì)胞仍能夠在移植時(shí)定植于睪丸并產(chǎn)生分化的生殖細(xì)胞，這些生殖細(xì)胞可通過采用圓形精子細(xì)胞卵胞質(zhì)內(nèi)顯微注射和ICSI的方式產(chǎn)生健康后代。隨后，在各種動(dòng)物模型中精原干細(xì)胞體外增殖都取得了成功，包括大鼠<i style="font-size: 15px;">(Hamra et al，2005)</i>、牛<i style="font-size: 15px;">(Aponte et al，2008)</i>、豬<i style="font-size: 15px;">(Zhang et al，2017)</i>和樹鼩<i style="font-size: 15px;">（Li et al，2017)</i>。更重要的是，來自成年和青春期前人類睪丸組織的精原干細(xì)胞已實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)以期未來通過自體移植恢復(fù)生育力，并通過異種移植證實(shí)這些精原干細(xì)胞能在受體睪丸的生精小管中定植<i style="font-size: 15px;">(Sadri-Ardekani et al，2009、2011)</i>。<u>后續(xù)亦有報(bào)道僅培養(yǎng)基進(jìn)行微調(diào)的類似的人精原干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)</u> <i style="font-size: 15px;">(He et al，2010；Koruji，2012；Conrad et al，2014；Zheng et al 2014；Dong et al，2019)</i>。雖然這是對(duì)人精原干細(xì)胞體外增殖能力的原理證明，但其余體細(xì)胞同樣也在這種培養(yǎng)體系中增殖而導(dǎo)致體細(xì)胞過度增殖且精原干細(xì)胞比例非常低。因此，需要對(duì)人精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)一步特征化以提高精原干細(xì)胞的分離和增殖能力。已經(jīng)有幾個(gè)特異性分子標(biāo)志物應(yīng)用于人精原干細(xì)胞培養(yǎng)中<i style="font-size: 15px;">(He et al，2010；Kossack et al，2013；Smith et al，2014；Zheng et al，2014)</i>，同時(shí)最新的研究描述了幾種精原細(xì)胞亞型的基因表達(dá)譜<i style="font-size: 15px;">(Guo et al，2018；Hermann et al，2018；Wang et al，2018；Sohni et al，2019)</i>，但這些方法都不能精確識(shí)別出精原干細(xì)胞。<u>精原干細(xì)胞只能通過移植實(shí)驗(yàn)，利用干細(xì)胞自我更新和分化的特性從未分化的精原細(xì)胞群中最終分離出來</u>。在小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)精子形成的程度和精原干細(xì)胞移植數(shù)量幾乎呈線性關(guān)系<i style="font-size: 15px;">（Dobrinski et al，1999)</i>。少量文章報(bào)道小鼠睪丸中經(jīng)異種移植后帶有選擇性標(biāo)志物的精原干細(xì)胞可遷移到生精小管基底膜精原干細(xì)胞龕中<i style="font-size: 15px;">(LangenStroth et al，2014；Nickkholgh et al，2014）</i>。<u>精原干細(xì)胞的特定標(biāo)志物（或一組標(biāo)志物）將成為體外優(yōu)化精原干細(xì)胞增殖和發(fā)展精原干細(xì)胞移植治療標(biāo)準(zhǔn)方案的關(guān)鍵。</u></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">精原干細(xì)胞的臨床移植療法亦取決于精原干細(xì)胞體外增殖的穩(wěn)定性和安全性。關(guān)于精原干細(xì)胞在培養(yǎng)或分化過程中的遺傳和表觀遺傳穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)有限，主要涉及動(dòng)物模型<i style="font-size: 15px;">(Kanatsu-Shinohara et al，2005；Langenstroth-Rower et al，2017)</i>。 另一方面，在幾項(xiàng)研究中已證明在小鼠模型或人-小鼠異種移植模型中未培養(yǎng)或培養(yǎng)的精原干細(xì)胞移植在受體睪丸中3個(gè)月內(nèi)并未導(dǎo)致腫瘤，表明在這些研究中精原干細(xì)胞沒有致瘤轉(zhuǎn)化<i style="font-size: 15px;">(Nagano et al，2002；Sadri-Ardekani et al，2009；Sadri-Ardekani et al，2011；Nickkholgh et al，2014b)</i>。并且在小鼠模型中移植培養(yǎng)的SSCs后未發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組具有腫瘤風(fēng)險(xiǎn)及生存時(shí)長(zhǎng)的差異<i style="font-size: 15px;">(Mulder et al，2018)</i>。然而，我們?nèi)孕韪舾械姆椒▉砀唧w的說明SSCs移植的安全性，以及如何排除體外培養(yǎng)細(xì)胞潛在的基因和表觀遺傳變化。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><u>從睪丸活檢中獲取移植細(xì)胞的一個(gè)缺點(diǎn)是在活檢前癌細(xì)胞已經(jīng)浸潤(rùn)睪丸，從而在移植過程中引入癌細(xì)胞</u>。這種風(fēng)險(xiǎn)可能發(fā)生在非實(shí)體腫瘤患者，如白血病或血液轉(zhuǎn)移性腫瘤。盡管一些論文已經(jīng)報(bào)道了從睪丸細(xì)胞懸浮液中可能分選出白血病細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(Dovey et al., 2013; Sadri-Ardekani et al., 2014)</i>，其他研究則強(qiáng)調(diào)了在睪丸細(xì)胞準(zhǔn)備中的腫瘤細(xì)胞污染?？傊?，目前還沒有臨床方法可以排除睪丸細(xì)胞或組織樣本中潛在的癌癥污染可能。因此，這些樣本不能應(yīng)用于臨床細(xì)胞移植中。</p><p class="ql-block">綜上所述，在過去的十年中，研究精原干細(xì)胞移植治療以恢復(fù)兒童癌癥幸存者生育能力已在多個(gè)方面取得進(jìn)展。該治療中最關(guān)鍵的一步將是優(yōu)化精原干細(xì)胞體外繁殖，建立一種安全可行的精原干細(xì)胞自體移植治療方法。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b><u>睪丸組織自體移植</u></b></p><p class="ql-block">睪丸組織碎片移植提供了一種替代精原干細(xì)胞懸液移植的策略。這種方法使精原干細(xì)胞保持在其未暴露的生理微環(huán)境中，從而保留生殖細(xì)胞和其支持體細(xì)胞之間的相互作用。然而，只有排除腫瘤細(xì)胞存在后，睪丸活檢組織的自體移植才能用于恢復(fù)精子發(fā)生<i style="font-size: 15px;">(Kilcoyne and Mitchell, 2019)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">睪丸組織可以進(jìn)行異位或原位移植。最早在小鼠模型中進(jìn)行睪丸組織異位移植，如腹膜間隙、耳或背部皮膚下<i style="font-size: 15px;">(Boyle et al，1975；Schlatt et al，2002)</i>。研究已在數(shù)個(gè)物種中報(bào)道了異種移植中的完整精子發(fā)生<i style="font-size: 15px;">(Honaramooz et al，2002；Schlatt et al，2002；Schlatt et al，2003；Honaramooz et al，2004；Oatley et al，2004；Snedaker et al，2004；Rathi et al，2006；Zeng et al，2006;Abrishami et al，2010；Liu et al，2016)</i>，但未在狨猴或人的異種移植模型中被報(bào)道<i style="font-size: 15px;">（Schlatt et al，2002；Wistuba et al，2004年)(Goossens et al，2008)</i>。與陰囊相比，這些異位部位溫度較高被認(rèn)為是移植物硬化或減數(shù)分裂停滯的原因。因此，有研究將睪丸組織移植到去勢(shì)動(dòng)物的陰囊，將未成熟的人類睪丸組織移植到免疫缺陷小鼠陰囊內(nèi)，發(fā)現(xiàn)睪丸組織中的精原干細(xì)胞仍保持增殖能力；通過組織形態(tài)檢測(cè)明確了這些精原干細(xì)胞可啟動(dòng)向成熟精子的分化過程<i style="font-size: 15px;">（Wyns et al，2007)</i>，然而根據(jù)電鏡特征及免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記顯示細(xì)胞分化異常<i style="font-size: 15px;">（Wyns et al，2008)</i>。將人類組織移植到睪丸白膜下(睪丸內(nèi)移植)可以提高成功恢復(fù)生育能力的潛能。在小鼠中，此種方法可以重新建立完整的精子發(fā)生過程而被證明是十分有效的 <i style="font-size: 15px;">(VanSaen et al，2009)</i>。將青春期前靈長(zhǎng)類動(dòng)物組織異體移植到小鼠睪丸中同樣實(shí)現(xiàn)了精子發(fā)生。迄今為止，將非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物未成熟睪丸組織移植到小鼠睪丸后獲得的最成熟的生殖細(xì)胞類型是由Boule Homolog和磷酸化H2A組蛋白家族成員X表達(dá)所確定的次級(jí)精母細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(Ntemou et al，2019b)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">與異位異種移植相比，青春期前人睪丸組織異種移植至小鼠睪丸會(huì)有更好的移植存活率和更好的生殖細(xì)胞分化起始狀態(tài)<i style="font-size: 15px;">(VanSaen et al，2011)</i>。盡管將人睪丸組織移植到小鼠睪丸內(nèi)可以觀察到減數(shù)分裂，但有報(bào)道稱精原干細(xì)胞大量丟失。據(jù)觀察這種損失可能是由于移植后的最初幾天缺氧導(dǎo)致移植物中央的生精小管的退化所致<i style="font-size: 15px;">（VanSaen et al，2013)</i>。為了減少精原干細(xì)胞損失，早期應(yīng)促進(jìn)對(duì)移植組織的血液供應(yīng)。在發(fā)育過程中以及成年時(shí)期，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是重要的血管生成調(diào)節(jié)因子<i style="font-size: 15px;">(Holmes and Zachary，2005)</i>。在牛體內(nèi)，VEGF處理后的移植物重量增加且更多的生精小管中含有長(zhǎng)型精子。與對(duì)照組相比，經(jīng)VEGF處理的移植物具有更好的血管特性<i style="font-size: 15px;">(Schmidt et al，2006) </i>。除了在血管生成中的作用，VEGF也調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)<i style="font-size: 15px;">(Caires et al，2012)</i>。在移植前先用VEGF在體外處理可防止干細(xì)胞死亡并刺激牛移植物細(xì)胞分化<i style="font-size: 15px;">(Caires et al，2009)</i>。將未成熟的人睪丸組織植入含VEGF納米顆粒的水凝膠中，血管重建和精子存活率得以改善<i style="font-size: 15px;">（Poels et al，2016)</i>，這也是睪丸內(nèi)異體移植前用VEGF體外預(yù)處理人睪丸組織的例子。然而，VEGF并不影響生殖細(xì)胞分化<i style="font-size: 15px;">(Ntemou et al，2019a）</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">自體移植已在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中進(jìn)行，當(dāng)睪丸組織碎片被移植到成年狨猴或恒河猴皮下時(shí)，研究者觀察到移植物細(xì)胞減數(shù)分裂停滯<i style="font-size: 15px;">（Luetjens et al，2008；Jahnukainen et al，2012)</i>。雖然移植到陰囊的片段重新建立完整的精子發(fā)生，但生精效率仍然很差<i style="font-size: 15px;">(Luetjen et al，2008，Jahnukainen et al，2012)</i>。 2016年，通過異位異種移植使用精子進(jìn)行ICSI后出生健康子代<i style="font-size: 15px;">(Liu et al，2016)</i>。在2019年，將獼猴的睪丸碎片移植到去勢(shì)的未成熟獼猴中（皮膚和陰囊下）顯示出高效的生育力恢復(fù)，在ICSI后獲得了1例健康雌性子代<i style="font-size: 15px;">(Fayomi et al，2019)</i>。無論是添加基質(zhì)膠還是冷凍保存，還是移植部位，都不會(huì)對(duì)有完整精子發(fā)生的生精小管比例產(chǎn)生影響。有趣的是，與其他研究相比，在上述這項(xiàng)研究中，移植的是較為少見的大片段組織(9-20mm3）。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">為了產(chǎn)生后代，異位或陰囊內(nèi)的睪丸組織移植總是與ICSI聯(lián)合。此外，<u>對(duì)于睪丸內(nèi)移植物，是否可以在移植物和內(nèi)源性生精小管之間建立連接，及確保形成一個(gè)有功能的排出系統(tǒng)，這仍然是一個(gè)懸而未決的問題</u>。然而，在嚙齒類動(dòng)物模型中的移植研究從未報(bào)道過附睪中存在供體來源的精子，因此，自然繁殖的機(jī)會(huì)可能很小。由于在睪丸內(nèi)/陰囊移植時(shí)缺乏排出系統(tǒng)，精子和液體可能積累并對(duì)睪丸上皮造成損害<i style="font-size: 15px;">(Pilsworth et al，1981)</i>。 因此，移植物中的精子發(fā)生可能不會(huì)無限期地進(jìn)行。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b><u>青春期前后雄性生殖細(xì)胞的體外分化</u></b></p><p class="ql-block">在建立有效去除腫瘤細(xì)胞污染的方案之前，惡性血液病男性患者的生育力保存依賴于體外生成精子的分離和凍存。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">90年代末的研究揭示了體外生成的精子在成年無精子癥患者生育力保存中的潛在應(yīng)用價(jià)值。研究報(bào)道，體外培養(yǎng)初級(jí)精母細(xì)胞48小時(shí)后，觀察到其分化為單倍體細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(Tesarik et al., 1999)</i>。接下來，這些具有功能的體外分化單倍體細(xì)胞可通過體外受精產(chǎn)生健康子代<i style="font-size: 15px;">(Tesarik et al., 1999)</i>。其它研究組的后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察到了相似的生精細(xì)胞分化現(xiàn)象。2003年發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)道，與Vero細(xì)胞共培養(yǎng)使精母細(xì)胞分裂成4個(gè)細(xì)胞，經(jīng)鑒定新產(chǎn)生的為單倍體精子細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(Tanaka et al., 2003)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">在2014年的一項(xiàng)研究中，常規(guī)條件下體外培養(yǎng)成年隱睪癥患者的精原干細(xì)胞7-10天，產(chǎn)生了具有功能的單倍體精子（DMEM/F12培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、全反式維甲酸和干細(xì)胞因子）。為了驗(yàn)證這些體外產(chǎn)生的單倍體細(xì)胞是否具有功能，將其注射到小鼠卵母細(xì)胞中，觀察到產(chǎn)生了8細(xì)胞的胚胎<i style="font-size: 15px;">(Yang et al.,2014)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">多個(gè)研究組報(bào)道功能性體細(xì)胞和生殖細(xì)胞體外培養(yǎng)并直接接觸是確保男性生殖細(xì)胞體外存活和分化的關(guān)鍵 <i style="font-size: 15px;">(Alves-Lopes and Stukenborg, 2017)</i>。除了不同細(xì)胞群的聯(lián)合培養(yǎng)，部分研究強(qiáng)調(diào)了原位生精上皮組成3D結(jié)構(gòu)所形成功能微環(huán)境的重要性。例如移植睪丸組織或睪丸類器官等三維環(huán)境被認(rèn)為是當(dāng)今最有前景的體外生育力保存工具<i style="font-size: 15px;">(Alves-Lopes and Stukenborg 2017; Oliver and Stukenborg 2019) </i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">歷史上在1964年進(jìn)行了首例性成熟前大鼠睪丸組織器官培養(yǎng)。將睪丸組織置于薄層瓊脂糖包被的金屬網(wǎng)上，使其能同時(shí)接觸培養(yǎng)基和空氣<i style="font-size: 15px;">(Steinberger et al., 1964)</i>，使用該方法培養(yǎng)2 ~ 3周后，12日齡大鼠睪丸組織中觀察到減數(shù)分裂并出現(xiàn)粗線期精母細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(Steinberger and Steinberger, 1965)</i>。隨后器官培養(yǎng)所用的金屬網(wǎng)格被一層半透膜替代。這種新模式使得在短期培養(yǎng)中維持組織結(jié)構(gòu)成為可能。使用這種膜系統(tǒng)進(jìn)行器官培養(yǎng)，能夠?qū)π猿墒烨靶∈蟛G丸組織的凍存方案進(jìn)行評(píng)估。這項(xiàng)研究證明了生精小管增長(zhǎng)、小管內(nèi)細(xì)胞增殖和減數(shù)分裂起始至偶線期精母細(xì)胞等現(xiàn)象<i style="font-size: 15px;">(Milazzo et al., 2008)</i> 。在人類青春期前睪丸組織培養(yǎng)能夠使精原細(xì)胞存活并保持生精小管結(jié)構(gòu)<i style="font-size: 15px;">(Kvist et al., 2006; Keros et al.,2007) </i>。然而，半透膜培養(yǎng)方案不能產(chǎn)生完整的精子發(fā)生過程。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">2010年研究者將性成熟前小鼠睪丸組織培養(yǎng)在瓊脂糖塊上并改良培養(yǎng)基配方，體外觀察到圓形精子產(chǎn)生<i style="font-size: 15px;">(Gohbara et al,2010) </i>。使用血清替代物代替胎牛血清后，首次在體外培養(yǎng)的新鮮性成熟前小鼠睪丸組織中觀察到完整的精子發(fā)生過程。隨后又通過體外受精獲得了具有繁殖能力的子代。在慢速冷凍或玻璃化凍存的性成熟前小鼠睪丸組織培養(yǎng)中也觀察到了類似的現(xiàn)象<i style="font-size: 15px;">(Yokonishi et al, 2014) </i>。在培養(yǎng)基中加入視黃醇培養(yǎng)新鮮或凍存的性成熟前小鼠睪丸組織，進(jìn)一步證實(shí)了體外存在精子生成過程 <i style="font-size: 15px;">(Arkoun et al., 2015)</i>。最近的研究中，微流控培養(yǎng)系統(tǒng)能夠使得單層睪丸組織在循環(huán)流動(dòng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)超過6個(gè)月，這項(xiàng)技術(shù)大大提高了體外培養(yǎng)的新鮮性成熟前小鼠睪丸組織產(chǎn)生減數(shù)分裂細(xì)胞的數(shù)量<i style="font-size: 15px;">(Komeya et al.，2017)</i> 。截至目前，只有小鼠睪丸組織能夠在體外進(jìn)行完整的精子發(fā)生過程，產(chǎn)生具有功能的精子。一項(xiàng)研究報(bào)道使用瓊脂糖培養(yǎng)性成熟前大鼠新鮮睪丸組織，可以觀察到完整減數(shù)分裂過程，但沒有產(chǎn)生長(zhǎng)形精子<i style="font-size: 15px;">(Reda et al., 2016)</i>。同年，使用殼聚糖培養(yǎng)新鮮大鼠和成年男性睪丸組織（使用雌激素治療的性別認(rèn)同障礙患者）來源的生精小管，產(chǎn)生了單倍體細(xì)胞。然而體外培養(yǎng)過程中，在第34天輸精管中可觀察到精子細(xì)胞，而生理情況下該現(xiàn)象應(yīng)在第72天出現(xiàn)<i style="font-size: 15px;">(Perrard et al., 2016)</i>。在最近的一項(xiàng)研究中，分別采用器官培養(yǎng)或3D培養(yǎng)技術(shù)，體外培養(yǎng)7~14歲男性患兒的睪丸組織或分離的細(xì)胞觀察到減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的細(xì)胞。另一項(xiàng)研究中，使用2~12歲男性患兒冷凍睪丸組織，采用體外器官培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生了單倍體細(xì)胞<i style="font-size: 15px;">(de Michele et al., 2018b)</i> 。然而，迄今為止沒有研究組報(bào)道使用青春期前人類睪丸組織培養(yǎng)出具有功能的完整精子。針對(duì)體外器官培養(yǎng)不能產(chǎn)生完整精子發(fā)生過程的分子機(jī)制研究，揭示了體外器官培養(yǎng)不能建立完整的血睪屏障<i style="font-size: 15px;">(de Michele et al., 2018a)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">特殊的內(nèi)分泌和旁分泌通路參與調(diào)控精子發(fā)生過程，但目前缺乏模擬上述通路的可靠方法和條件，因此這更加凸顯了我們需要更多研究以完善體外男性生育力保存的實(shí)驗(yàn)條件。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">睪丸組織凍存的倫理問題</b></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">?目前所涉及的倫理問題主要是青春期前男性的生育力保存仍是一種實(shí)驗(yàn)性質(zhì)的技術(shù)。涉及兒童的臨床研究一方面需要嚴(yán)格平衡負(fù)擔(dān)和風(fēng)險(xiǎn)，另一方面要嚴(yán)格平衡兒童的預(yù)期獲益<i style="font-size: 15px;">（Lee，2018）</i>。值得注意的是，由于其臨床應(yīng)用的有效性尚未得到證實(shí)，只有將兒童的風(fēng)險(xiǎn)及負(fù)擔(dān)控制在最小限度，才能實(shí)施這項(xiàng)技術(shù)。因此，與建議青春期后的患者冷凍保存精子相反，為青春期前男性患兒進(jìn)行睪丸組織冷凍，在某些情況下倫理上允許，但從倫理角度看卻不是必須的<i style="font-size: 15px;">（McDougall et al.，2018）</i>。一些學(xué)者建議，睪丸組織凍存不應(yīng)該僅局限于實(shí)驗(yàn)室階段<i style="font-size: 15px;">（Ruutiainen et al.，2013）</i>。然而，在沒有足夠安全保障的情況下貿(mào)然應(yīng)用新技術(shù)是極不負(fù)責(zé)任的，目前來看，將睪丸組織冷凍技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室中直接應(yīng)用于臨床還為時(shí)尚早，一方面由于這項(xiàng)技術(shù)可能會(huì)對(duì)患兒（包括其家長(zhǎng)）帶來潛在的不良影響；另一方面該技術(shù)所需的三個(gè)步驟（取材，組織凍存，再移植）并未滿足開展新醫(yī)療技術(shù)的基本原則，因?yàn)槠湓砩形丛谌梭w中得到驗(yàn)證，從而缺乏安全性、可操作性以及有效性的數(shù)據(jù)<i style="font-size: 15px;">(Provoost et al., 2014)</i>。允許將其從實(shí)驗(yàn)室中直接應(yīng)用于臨床的計(jì)劃應(yīng)該被重視，然而其使用又不能超出目前的科學(xué)現(xiàn)狀<i style="font-size: 15px;">(Mertes and Pennings, 2013)</i>。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">生育具有血緣關(guān)系子代的重要性以及對(duì)科學(xué)進(jìn)步的信念將決定這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值。父母對(duì)于科學(xué)進(jìn)展使冷凍睪丸組織在未來可用的信念，將會(huì)影響他們讓孩子接受睪丸組織冷凍的意愿<i style="font-size: 15px;">(Ginsberg et al., 2014)</i>。這種想法打破了技術(shù)原有的傷害與利益之間的平衡。同樣，當(dāng)對(duì)科學(xué)進(jìn)步的信念變成對(duì)治療的誤解或錯(cuò)誤預(yù)期時(shí)，人們可能也會(huì)感到疑惑。此外，在預(yù)想科學(xué)進(jìn)步的同時(shí)，其他可替代的技術(shù)發(fā)展也應(yīng)當(dāng)被考慮。干細(xì)胞來源的生殖細(xì)胞在未來將成為可能，比如源自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而就沒有必要通過外科手術(shù)獲取睪丸組織<i style="font-size: 15px;">(Hayashi et al.,2011)</i>。然而，目前還沒有成熟可行的方法使人類多能干細(xì)胞分化成為具有功能的精子。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">實(shí)施生育力保存的主要理由是使生育血親子代成為可能。很多研究提示癌癥存活患者非常關(guān)注自己的生育力，這也進(jìn)一步確定了這種可能的重要性。然而，另一個(gè)反映這種重要性的指標(biāo)是凍存生物樣本的使用率。雖然多數(shù)癌癥患者希望生育血親子代，但目前在癌癥患者中冷凍精子的使用率非常低<i style="font-size: 15px;">(Ferrari et al., 2016)</i>。睪丸組織再移植所需的醫(yī)療費(fèi)用使得在睪丸組織冷凍保存后使用這種技術(shù)的男性更少。因此對(duì)未來使用冷凍樣本的后續(xù)研究對(duì)于倫理評(píng)估而言是很有必要的。</p><p class="ql-block"><br></p> <p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">睪丸組織后續(xù)的挑戰(zhàn)</b></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">由于睪丸組織移植是一種相對(duì)簡(jiǎn)單的技術(shù)，并且已在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中成功實(shí)施，因此下一步將是在人類中進(jìn)一步驗(yàn)證其原理。為了能有機(jī)會(huì)檢測(cè)到精子，該領(lǐng)域的一些專家曾建議，將多個(gè)睪丸組織碎片移植到身體的不同部位。然而，值得注意的是，睪丸組織移植還涉及到未來的第二次手術(shù)，即在接受輔助生殖時(shí)需要外科方法取精。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">對(duì)于存在腫瘤細(xì)胞污染睪丸組織風(fēng)險(xiǎn)的患者，如何確保將腫瘤細(xì)胞從睪丸組織中去除需要進(jìn)一步研究。由于SSCs在小鼠體內(nèi)的移植效率很低，并且來自青春期前男性的睪丸活檢組織體積小且僅含少量SSCs，因此在移植前SSCs應(yīng)先在體外培養(yǎng)，以增加恢復(fù)生育能力的機(jī)會(huì)。然而，體外培養(yǎng)系統(tǒng)在適用于臨床之前，需要進(jìn)一步優(yōu)化其有效性及安全性。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">作為移植的另一種替代方法，利用患者睪丸組織體外培養(yǎng)精子可能是未來的一種選擇；然而，這種方法在適用于臨床之前，還需要進(jìn)一步的深入研究<span style="color: rgb(237, 35, 8);">（表2）</span></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="color: rgb(237, 35, 8);">表2 男性生育力保存領(lǐng)域現(xiàn)存的挑戰(zhàn)</b></p><p class="ql-block"><b>臨床挑戰(zhàn)</b></p><ul class="ql-block"><li>優(yōu)化患者入選和排除標(biāo)準(zhǔn)</li><li>睪丸組織收集和凍存流程的標(biāo)準(zhǔn)化</li><li>優(yōu)化睪丸組織從獲取地到凍存地之間的管理和運(yùn)輸流程</li><li>制定儲(chǔ)存前后的質(zhì)量保證措施</li><li>制定檢測(cè)睪丸微小殘留病變的方法</li><li>制定睪丸活檢后患者隨訪流程</li><li><b>研究挑戰(zhàn)</b>制定篩選SSCs及/或清除腫瘤細(xì)胞的方法</li><li>優(yōu)化SSCs體外培養(yǎng)的方法學(xué)</li><li>證實(shí)人類睪丸組織及SSCs自體移植的概念</li><li>制定人類SSCs體外成熟培養(yǎng)的方法</li><li>評(píng)估凍存、培養(yǎng)、移植的SSCs及體外獲取精子的遺傳及表觀遺傳穩(wěn)定性及安全性</li><li>評(píng)估生育力恢復(fù)后獲取的精子的受精能力</li></ul><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block" style="text-align: center;"><b style="color: rgb(22, 126, 251); font-size: 20px;">結(jié) 論</b></p><p class="ql-block">在世界范圍內(nèi)，為有生殖細(xì)胞減少風(fēng)險(xiǎn)的青春期前男性患兒提供生育力保存治療在不斷增加。自2012年第一次調(diào)查研究以來，睪丸組織保存的患者數(shù)量由266例增加至1033例。與此同時(shí)，恢復(fù)生育力的方法也取得了重要的科學(xué)進(jìn)展。精原干細(xì)胞移植技術(shù)已被施用于尸體睪丸；睪丸組織移植的概念已在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中驗(yàn)證；體外精子發(fā)生也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block">考慮到已取得的進(jìn)展和仍需克服的障礙，第一批有資格接受睪丸組織或細(xì)胞懸液自體移植的患者，很可能是那些需要治療的非轉(zhuǎn)移實(shí)體腫瘤和非惡性疾病的患者，對(duì)于這些患者，沒有將腫瘤細(xì)胞帶入睪丸的風(fēng)險(xiǎn)。然而，除非生育力保存的安全性及有效性得到臨床試驗(yàn)進(jìn)一步的證實(shí)，為實(shí)現(xiàn)生育力保存的睪丸組織凍存技術(shù)仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段。</p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">致謝</b></p><p class="ql-block"><span style="font-size: 15px;">感謝國際男科學(xué)會(huì)（ISA）、歐洲人類生殖與胚胎學(xué)學(xué)會(huì)（ESHRE）和所有為本次調(diào)查收集數(shù)據(jù)做出貢獻(xiàn)的中心。感謝各部門及機(jī)構(gòu)在本文撰寫過程中給予的支持。</span></p><p class="ql-block"><span style="font-size: 15px;">R.B.，K.J.和J.-B.S.是在冰島、芬蘭和瑞典進(jìn)行的關(guān)于青春期前男性生育力保存的NORDFERTIL研究項(xiàng)目代表。K. E.O.是美國生殖醫(yī)學(xué)會(huì)代表。</span></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">作者的角色</b></p><p class="ql-block"><span style="font-size: 15px;">E.G.，N.N和J.B.S.領(lǐng)導(dǎo)了項(xiàng)目的準(zhǔn)備、起草和編輯審查。N.N.分析調(diào)查數(shù)據(jù)。所有其他作者為數(shù)據(jù)收集和手稿起草做出了貢獻(xiàn)。</span></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">資金</b></p><p class="ql-block"><span style="font-size: 15px;">歐洲人類生殖和胚胎學(xué)學(xué)會(huì)；MRC Center Grant（MR / N022556 / 1至R.T.M.）；瑞典兒童癌癥基金會(huì)（TJ2016-0093至J.-B.S.）；研究基金會(huì)-法蘭德斯（FWO-G010918N至E.G.）； Kom Op tegen kanker（KOTK至E.G.）；荷蘭衛(wèi)生研究與開發(fā)組織（ZonMw 116003002至 A.M.M.v.P.）；比利時(shí)癌癥控制基金會(huì)（FDC 2016-141至C.W.）；FNRS Televie（7.4596.13、7.4554.14F和7.6511.16至C.W.）</span></p><p class="ql-block"><br></p><p class="ql-block"><b style="color: rgb(22, 126, 251);">利益沖突聲明 </b></p><p class="ql-block"><b>無</b></p><p class="ql-block"><br></p> <h1><div style="text-align: center;"><b><font color="#ed2308">Care · Discover · Teach</font></b></div><div style="text-align: center;"><b><font color="#ed2308"><br></font></b></div><b><div style="text-align: center;"><b><font color="#ed2308">關(guān)愛 · 探索 · 教導(dǎo)</font></b></div></b></h1>