2020諾貝爾化學(xué)獎: CRISPR/Cas9基因編輯工具蔣正堯 <p>CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng)。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后，能夠把病毒基因的一小段存儲到自身的 DNA 里一個稱為 CRISPR 的存儲空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效。</p><p>CRISPR（成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列），就是這段等待編輯的基因序列，Cas9就是科學(xué)家選出來負(fù)責(zé)進(jìn)行DNA剪切的蛋白酶。</p> <p>它有一個資料庫（CRISPR），用來儲存病毒的資料，也就是它們的DNA片段。其中有些重復(fù)出現(xiàn)的DNA片段，就相當(dāng)于一塊塊擋板，把不同的病毒DNA隔開。</p><p> 另外，它還有一家武器工廠（Cas），負(fù)責(zé)生產(chǎn)各種Cas蛋白質(zhì)，你可以把它們想象成不同款式的剪刀。</p> <p> CRISPR 系統(tǒng)包含了三個元件：tracrRNA, CRISPR RNA和 Cas9酶。</p><p>1987日本石野純良: 在這些片段間，細(xì)菌會加入一些重復(fù)的堿基編碼，例如…CGGTTT…CGGTTT…CGGTT…，其中省略號的部分代表來自病毒的DNA片段，而CGGTT就是細(xì)菌或者古細(xì)菌基因組中反復(fù)出現(xiàn)的神秘序列。</p> <p>為釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes），從中發(fā)現(xiàn)了一種之前未知的RNA分子——tracrRNA。她的研究表明，tracrRNA是細(xì)菌的古老的免疫系統(tǒng)——CRISPR/Cas的一部分，它可以通過裂解病毒的DNA來瓦解病毒。</p><p><br></p> <p>在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中，酶Cas9在病毒DNA靶位點上進(jìn)行切割，其中這種靶位點是這樣確定的：一種被稱作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列與另一種被稱作tracrRNA的RNA分子，通過堿基配對結(jié)合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列與靶DNA位點進(jìn)行堿基配對，以這種方式，這種嵌合RNA就能夠引導(dǎo)Cas9結(jié)合到這個靶位點上并進(jìn)行切割，也因此這種嵌合RNA也被稱作向?qū)NA（guide RNA, gRNA）。</p> <p>2011年，Emmanuelle Charpentier將CRISPR-Cas9系統(tǒng)描述成: 由兩種形成RNA雙鏈的RNA分子——tracrRNA和pre-crRNA，其中tracrRNA 對crRNA前體進(jìn)行加工，讓后者變成由成熟的crRNA和蛋白Cas9（之前被稱作Csn1）組成。</p><p> 首先Cas9需要結(jié)合到病毒DNA上，并打開DNA的雙鏈?zhǔn)筩rRNA能與DNA的一條單鏈進(jìn)行堿基配對，配對成功則會誘導(dǎo)Cas9的兩個核酸酶功能模塊同時剪切兩條DNA單鏈，使DNA斷裂。隨著crRNA的變換，該系統(tǒng)幾乎可以剪切所有能夠與crRNA配對的病毒DNA序列。</p> <p> 人類從此開始揮舞上帝的手術(shù)刀，修改自身的遺傳信息，對抗億萬年進(jìn)化留給自己的病痛折磨。”浙大王立銘《基因編輯簡史：上帝的手術(shù)刀》。這一研究: 個人一小步，人類一大步。</p> <p>開始發(fā)表文章不突出，一直不被重視，實驗室慘淡經(jīng)營了7年。雖然如此，她依然想要理解細(xì)菌中未知的生物化學(xué)過程。2008年 Charpentier 在于默奧建立實驗室后，研究開始走上快車道。她與馬普感染生物學(xué)研究所的分子微生物學(xué)家 J?rg Vogel 合作，利用下一代測序技術(shù)繪制了化膿性鏈球菌的轉(zhuǎn)錄圖譜，并找到了一類新型小RNA，被稱作 trans-activating CRISPR RNA（tracrRNA），她與同事發(fā)現(xiàn)tracrRNA、CRISPR RNA（crRNA）和Cas9一起作用于入侵的噬菌體DNA，作為化膿性鏈球菌的一種獲得性免疫機(jī)制，這項工作于2011年在 Nature 發(fā)表 [1]，可以說是找到了打開基因編輯大門的鑰匙。</p> <p>瑞典皇家科學(xué)院: 2020年諾貝爾化學(xué)獎授予加州大學(xué)詹妮弗·杜德納（ Jennifer Doudna） 和現(xiàn)在德國工作的法國科學(xué)家Emmanuelle Charpentier，表彰她們發(fā)明基因修飾方法CRISPR-Cas9。</p> <p>1. Deltcheva, E., et al., CRISPR RNA</p><p> maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 2011. 471(7340): p. 602-7. </p><p> 2. Jinek, M., et al., A programma-ble dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012. 337(6096): p. 816-21.</p> <p>Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna的合作，發(fā)現(xiàn)使用重組Cas9蛋白(來自在大腸桿菌里表達(dá)的化膿性鏈球菌[S. pyogenes]的基因)，和體外轉(zhuǎn)錄的crRNA及tracrRNA可以在體外切割純化的DNA, 并成功編輯了大腸桿菌基因。此外, 她們證明crRNA和tracrRNA對Cas9發(fā)揮作用都是必需的, 兩種RNA在被融合為單一的導(dǎo)向RNA(single guide RNA, sgRNA)時也可以在體外發(fā)揮作用。</p> <p>分子遺傳學(xué)的三座里程碑：基因測序技術(shù)、PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），以及CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。</p> <p class="ql-block">CRISPR-Cas9系統(tǒng)通過將一個特定的DNA序列，引導(dǎo)到目標(biāo)基因上，使Cas9酶能夠準(zhǔn)確地剪切這段DNA。一旦DNA被剪切，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制就會介入，并嘗試修復(fù)這個斷裂點。在修復(fù)過程中，我們可以利用一些技術(shù)手段來引導(dǎo)細(xì)胞使用特定的修復(fù)機(jī)制，從而實現(xiàn)對目標(biāo)基因的修改。</p> <p>湖南科學(xué)技術(shù)出版社·原力，2020年11月出版</p>